flag标签抗体

蛋白质标签和标签蛋白抗体。

标签蛋白是一类与目的蛋白融合表达的多肽或蛋白,以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化。

主要分为两类,一类是分离纯化目的蛋白的亲和吸附标记。

蛋白质纯化→His标签;

蛋白质印迹→旗帜标签;

免疫共沉淀→Flag、HA或cMyc标记;

另一类是自体荧光标签,主要用于监测目的蛋白的动态表达和代谢。荧光素酶报告基因系统(上一期介绍)和荧光蛋白家族是常用的。

标签蛋白抗体是一种经过亲和纯化的小鼠单克隆抗体。用于检测标签序列(如MyC、His、GST、HA等。)在各种商业表达载体上,从而分析检测目的蛋白的表达量和功能。

其原理是抗原抗体反应,这些标签抗体可以高特异性地与相应的标签融合蛋白结合。标记抗体是研究基因蛋白表达、信号转导和基因功能的常用工具。

一、亲和吸附标签

亲和标签是纯化重组蛋白的重要而有效的工具。它们不仅便于融合蛋白的检测和纯化,而且可能对目的蛋白的物理和化学性质产生有益的影响,包括增加重组蛋白的产量、增强重组蛋白的溶解性和促进重组蛋白的正确折叠。常用的标签有6*His(6个组氨酸)、Flag、HA、c-Myc和GST标签。

20种氨基酸的名称和缩写:

丙氨酸(Ala-A)、缬氨酸(Val-V)、亮氨酸(Leu-L)、异亮氨酸(ile-I)、

脯氨酸(Pro-P)、甘氨酸(Gly-G)、蛋氨酸(Met-M)、色氨酸(Trp-W)、

苯丙氨酸(Phe-F),谷氨酰胺(Gln-Q),丝氨酸(Ser-S),苏氨酸(Thr-T),

Cys-C,天冬酰胺(Asn-N),酪氨酸(Tyr-Y),天冬氨酸(Asp-D),

谷氨酸(Glu-E)、赖氨酸(Lys-K)、精氨酸(Arg-A)和组氨酸(His-H)。

①根据实验目的选择合适的标签;

②确定标签蛋白是否干扰目的蛋白的表达;

③确定标签蛋白的位置是在目的蛋白的N端还是C端。

6*His:

6*His是指由六个组氨酸残基组成的融合标签,可以插入目的蛋白的C端或N端。作为标记,可以形成表位,用于纯化和检测;第二,独特的结构特征(结合配体)有利于纯化。组氨酸残基的侧链与固体镍有很强的吸引力,可用于固定化金属螯合色谱(IMAC)分离纯化重组蛋白。

使用His-tag有以下特点:

1.标签的分子量较小,只有~0.84KD,一般不影响目的蛋白的功能;

2.2的融合蛋白。His标签可以在非离子表面活性剂或变性条件下纯化。前者用于纯化疏水性强的蛋白质,后者对纯化包涵体蛋白质特别有用。用高浓度变性剂溶解后,用金属螯合亲和层析除去杂质蛋白,使复性不受其他蛋白干扰,或者用金属螯合亲和层析进行复性。

3.他的标签融合蛋白也被用于研究蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA之间的相互作用。

4.4的免疫原性。他的标签比较低,纯化后的蛋白可以直接注射到动物体内进行免疫制备抗体;

5.可应用于多种表达系统,纯化条件温和;

6.父标签和标签可以与其他相似性标签一起构建。

Flag标签蛋白是一种亲水性多肽(DYKDDDDK),编码8个氨基酸。是第一个为融合蛋白设计的表位标签,也是唯一申请专利的标签。标签中多个带负电荷的氨基酸不可能影响目标蛋白的活性。带有FLAG标签的蛋白质可以被特异性抗体M1、M3和M5识别或回收。FLAG已用于细菌、酵母和哺乳动物细胞。3X FLAG可以提高对FLAG标签的检测。

FLAG作为标签蛋白,融合表达目的蛋白后具有以下特征:

1.flag作为一种融合表达标签,通常不与目的蛋白相互作用,不影响目的蛋白的功能和性质,所以研究人员习惯于对融合蛋白进行下游研究;

2.与FLAG融合的目的蛋白可以直接通过FLAG进行亲和层析,这是非变性纯化,可以纯化出活性融合蛋白,纯化效率高;

3.FLAG作为一种标签蛋白,可被抗FLAG抗体识别,便于用WesternBlot等方法检测和鉴定含有FLAG的融合蛋白;

4.FLAG融合到N-末端,可被肠激酶(DDDK)切除,从而获得特异性目的蛋白。因此,FLAG标签被广泛应用于蛋白质表达、纯化、鉴定、功能研究和蛋白质相互作用等相关领域。

HA标签蛋白,标签序列为YPYDVPDYA,是流感病毒来源的血凝素的表面抗原决定簇,有9个氨基酸,对外来目的蛋白的空结构影响不大,易于构建标签蛋白并融合到N端或C端。用抗HA抗体和酶联免疫吸附试验易于检测。

c-Myc

C-Myc标签蛋白,Myc标签包含具有10个氨基酸的人原癌基因Myc的片段(EQKLISEEDL)。这10个氨基酸作为抗原表位表达,在不同的蛋白质框架中仍能识别其对应的抗体。由于其高度特异性的抗Myc单克隆抗体,它被广泛用于检测系统。它很少用于净化。Myc标签已经用于蛋白质印迹、免疫荧光和免疫沉淀实验。

V5

V5表位标签GKPIPNPLLGLDST来自副粘病毒的P/V蛋白。副粘病毒是一种反义RNA病毒,可引起一些常见的人类疾病,如腮腺炎、麻疹、支气管炎、肺炎和喘息。V5标签通常用于哺乳动物和昆虫表达系统。虽然它也用于蛋白质纯化,但标签通常用于蛋白质检测,例如在蛋白质印迹、免疫荧光和免疫沉淀实验中。

i标签

iTag标签蛋白是一个15个氨基酸的短肽,具有一个生物素化的赖氨酸位点,与已知的天然生物素化序列完全不同,可以添加到目的蛋白的N端和C端。融合表达后,可被生物素连接酶生物素化。为了纯化重组蛋白,选择了低亲和力的单体亲和素或亲和素衍生物,不仅用于蛋白质的分离纯化,还用于蛋白质相互作用的研究。

i Tag标签系统具有以下特点:

1.在体外和体内,几乎所有的蛋白质都可以在一个独特的iTag位点被容易且有效地生物素化;

2.生物素是通过酶与底物的反应实现的,反应条件十分温和,标记的特异性极高;

3.生物素iTag只有15个氨基酸,对蛋白质空的结构影响不大。

商品和劳务税

GST(谷胱甘肽硫转移酶)标签蛋白本身是一种在解毒中起重要作用的转移酶,其天然大小为26KD。主要用于原核表达,其应用于原核表达有两个原因。一个是它是一种高溶解性的蛋白质,希望可以用来增加外源蛋白质的溶解性;另一个是可以在大肠杆菌中大量表达,可以提高表达水平。

GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达,可在大肠杆菌、酵母等宿主细胞中表达。在非变性条件下,用10mM还原型谷胱甘肽洗脱结合的融合蛋白。在大多数情况下,融合蛋白可溶于水溶液并形成二聚体。

GST标签可以很容易地通过酶分析或免疫测定来检测。标记有助于保护重组蛋白不被胞外蛋白酶降解,提高其稳定性。大多数情况下,GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

纯化:由该表达系统表达的GST标签蛋白可以通过含有还原谷胱甘肽琼脂糖的亲和树脂从细菌裂解物中直接纯化。GST标签蛋白可以在温和的非变性条件下洗脱,从而保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去与谷胱甘肽树脂的结合能力,因此无法在纯化缓冲液中加入盐酸胍或尿素等强变性剂。

如果要去除GST融合部分,可以通过位点特异性蛋白酶去除。

检测:GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体可用于检测。

相扑

SUMO标签蛋白是一种小的泛素样修饰蛋白(
),是泛素样多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上,SUMO和泛素只有18%的同源性,但三级结构和生物学功能非常相似。发现SUMO可以作为融合标签和重组蛋白表达的分子伴侣,不仅可以进一步提高融合蛋白的表达,还具有抵抗蛋白酶水解、促进目的蛋白正确折叠和提高重组蛋白溶解性的功能。

此外,相扑还有一个重要的应用,就是可以用来完全切断标签蛋白,得到天然蛋白。因为SUMO蛋白水解酶可以识别SUMO标签蛋白的完整序列,并高效地将SUMO从融合蛋白上切割下来。去除SUMO后,通过亲和层析去除标记的蛋白质,获得作为天然蛋白质的重组蛋白质。因此,SUMO标签经常与其他标签一起用作特定的酶水解位点。

光环标签

卤素标签标签蛋白是脱卤素酶的遗传修饰衍生物,可以共价结合各种合成的卤素标签配体。这种分子量为33KDa的单体蛋白可以融合到重组蛋白的N端或C端,在原核和真核系统中表达。

卤标签配体是一种小分子化学物质,在体外或体内都能共价结合卤标签蛋白。这些配体由两个关键成分组成:(1)通用的卤素标签反应接头,其结合卤素标签蛋白;(2)一种是官能团,如荧光染料或亲和介质。

共价和特异性结合各种合成报道基团和亲和配体的能力使得晕标记蛋白能够用于检测和亲和结合或靶蛋白的固相固定。

快照标记

SNAP-Tag是新一代的蛋白质标记技术,不仅特异性高,而且稳定。其最大的优点是适用于各种环境中蛋白质的检测和纯化,如活细胞、溶液或固相(如SDS-PAGEgels)。

SNAP-Tag是从人烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶获得的。无论在体内还是体外,SNAP-Tag都可以高特异性地共价结合底物,使蛋白质被生物素或荧光基团(如荧光素和罗丹明)标记。

SNAP携带的活性巯基位点接受苄基鸟嘌呤携带的侧链苄基,释放鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价键合使得SNAP携带的目的蛋白带有苄基携带的标签。苄基鸟嘌呤在生化条件下是稳定的,没有其他蛋白质会与这类物质相互作用,所以SNAP tag反应的特异性很高。

检测:生物素或具有各种颜色荧光的底物(如荧光素、罗丹明)可以穿透细胞,方便快捷地进行活细胞中SNAP-Tag融合蛋白的标记和检测。它们还可以特异性标记大肠杆菌、酵母和哺乳动物的细胞提取物或纯化蛋白溶液中的SNAP-tag融合蛋白。

当纯化或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与表面固定有苯鸟嘌呤的底物混合时,该蛋白可以特异性地与底物相互作用,形成共价键,融合蛋白间接固定在底物表面,可以更方便快捷地达到研究蛋白质功能或纯化蛋白质的目的。

MBP

MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白的大小为40kDa,由大肠杆菌K12的雄性基因编码。MBP可以增加在细菌中过量表达的融合蛋白,尤其是真核生物蛋白的溶解性。MBP标签可以很容易地通过免疫分析检测出来。有必要用位点特异性蛋白酶切割标签。如果蛋白质在细菌中表达,MBP可以融合到蛋白质的N-末端或C-末端。

纯化:融合蛋白可通过交联淀粉亲和层进一步纯化。结合的融合蛋白可以用生理缓冲液中的10mM麦芽糖洗脱。结合亲和力在微摩尔范围内。一些融合蛋白在0.2%Triton X-100或0.25%Tween 20的存在下不能有效结合,而另一些则不受影响。缓冲条件为ph 7.0 ~ 8.5,盐浓度可高达1M,但不能使用变性剂。如果要去除MBP的融合部分,可以通过位点特异性蛋白酶去除。

检测:可用MBP抗体或表达的目的蛋白的特异性抗体进行检测。

第二,荧光蛋白

荧光蛋白荧光团没有种属特异性,不依赖任何介质发光,因此转入宿主细胞的荧光蛋白基因表达非常稳定,对大多数宿主细胞没有影响,可以展示单个或多个基因的表达。此外,在细胞转染实验中,通过载体上的荧光蛋白可以清楚直观地观察细胞的转染效率。

eGFP/eCFP/eYFP/mCherry

分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白,具有不同的激发波长和发射波长,均由野生型荧光蛋白经过氨基酸突变和密码子优化制成。更常见的是,它们应该是报告基因。

就eGFP而言,其荧光强度比GFP更强,荧光性质更稳定。同时,载体中构建的科萨克序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中的表达效率更高。MCherry是一种性能最好的单体红色荧光蛋白,由DsRed进化而来。可与GFP系列荧光蛋白配合使用,实现多色标记。体外和体内实验表明,当mCherry在N-末端和C-末端融合外源蛋白时,荧光蛋白的活性和融合的目的蛋白的功能互不影响。

在目标蛋白融合表达后,这些荧光标记蛋白具有以下特征:

1.不破碎组织和细胞,不添加任何底物,直接通过荧光显微镜在活细胞内发出绿色荧光,实时显示目的基因的表达,荧光性质稳定,因此被誉为活细胞探针;

2.其自身荧光可以推断靶基因在细胞中的位置,而无需使用靶基因的抗体或原位杂交技术;

3.同时,细胞中的其他产物不会干扰标签蛋白的检测,使得检测更加快速、简便、灵敏、重现性好;

4.其低消耗和高灵敏度检测非常适合高通量药物筛选。因此,eGFP表达标签被广泛应用于群体表达调控、转基因功能研究、细胞内蛋白质功能定位、迁移变化和药物筛选。

5.mCherry红色荧光蛋白在标记病毒颗粒和研究病毒与宿主细胞的关系方面具有独特的优势。例如,通过用mRFP或mCherry标记HIV病毒颗粒来研究HIV与宿主细胞的相互作用以及HIV感染的过程,通过用mRFP标记慢病毒颗粒来研究慢病毒在小鼠体内的复制过程。

标签抗体,别名表位,又称抗原决定簇,是抗原分子中决定抗原特异性的特殊区域或基团,是与抗体特异性结合的结构或序列。随着生物技术的发展,研究人员可以通过DNA重组技术构建含有目的基因和表位标签的融合蛋白,然后通过特异性标签抗体对其进行鉴定和纯化,以满足研究需要。常用的标签有myc、HA、Flag、His、GST等。

1.Flag标签-抗flag标签抗体

Flag标签系统使用一个短的亲水性八氨基酸肽(DYKDDDDK)来融合到靶蛋白上。Flag标签可以位于蛋白质的C端或N端。该系统已广泛应用于各种细胞类型,包括细菌、酵母和哺乳动物细胞,相应的Flag标签抗体也得到广泛应用。因为Flag标签系统的纯化条件是非变性的,所以可以纯化所有活性融合蛋白。添加肠激酶可以去除Flag标签,肠激酶特异性识别肽序列C端的5个氨基酸残基。Flag抗体可用于检测带有Flag标签的融合表达蛋白的表达和细胞内定位,以及纯化、定性或定量检测Flag的融合表达蛋白。

2.他的标签-抗他的标签抗体

His标签是由六个组氨酸(his-his-his-his-his)组成的短肽,专门用于吸附和纯化重组蛋白。由于其分子量小,易于分离纯化,His融合标签与其他标签相比有很多明显的优势,是目前纯化应用最广泛的融合标签。利用His标签可以建立基于融合蛋白的高效检测和纯化系统。His抗体可用于检测具有His标签的融合表达蛋白的表达和细胞内定位,以及纯化、定性或定量检测His的融合表达蛋白。

3.GST标签-抗GST标签抗体

GST标记系统具有蛋白表达量高、表达产物纯化方便、有利于制备GST抗体的特点。GST融合蛋白可溶于水溶液,可从细菌裂解液中提取,不经变性即可通过亲和层析获得。GST融合蛋白可以被位点特异性蛋白酶切割以去除GST蛋白。融合蛋白也是非常好的强免疫原,所以很容易制备针对新蛋白的抗体。正是由于上述优点,目前商用的GST融合蛋白表达系统和GST标签抗体系统仍被广泛使用。近年来,谷胱甘肽S转移酶GST的表达和纯化系统在原核表达系统中得到了更广泛的应用。

4.Myc标签-抗Myc标签抗体

Myc标签(sequence:eqkliseodl)已成功用于WB杂交、免疫沉淀IP和流式细胞术,并可用于检测重组蛋白在细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞中的表达。通过将Myc标记的抗体偶联到二乙烯砜活化的琼脂糖上,可以亲和纯化Myc重组蛋白。Myc标签可以放置在C-末端或N-末端,但Myc重组蛋白的低pH洗脱条件往往会降低蛋白的活性,因此Myc标签系统广泛用于检测,但很少用于纯化。

5.HA标签-抗HA标签抗体

HA标签来源于人类流感血凝素的氨基酸98-106,并通过HA的短肽(流感血凝素表位:ypydvpdya)与靶蛋白融合。HA标签具有很强的免疫反应性,广泛应用于HA融合靶蛋白的分离、纯化、检测和示踪。通过使用与高特异性HA单克隆抗体偶联的树脂,可以有效地纯化重组HA标签蛋白。HA标签系统可以位于蛋白质的C-末端或N-末端。该系统已广泛应用于多种细胞类型,相应的HA标签抗体也被广泛使用。HA标签抗体可以特异性识别在C-末端或N-末端带有HA标签的融合蛋白。

6.GFP标签-抗GFP标签抗体

绿色荧光蛋白(简称GFP)在蓝色波长范围的光激发下发出绿色荧光。GFP或其突变体EGFP广泛用于检测基因表达效率,与靶蛋白融合表达用于检测靶蛋白的表达和分布。一般来说,GFP抗体不仅可以检测GFP或其适当突变体,还可以检测GFP或其适当突变体融合表达蛋白的表达和细胞内定位,以及纯化、定性或定量检测GFP融合表达蛋白。

flag标签抗体

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