单细胞分离仪 可视化单细胞分选仪

单细胞分离仪 可视化单细胞分选仪图片来源@全景视觉

文淑vb动脉网,曹西安写的。

提到2019年基因测序的发展,“单细胞测序”无疑是关键词。

2019年9月,美国单细胞测序公司10x Genomics在纳斯达克上市,IPO 3.9亿美元,成为该领域的领头羊。国内单细胞测序行业发展滞后,但也受到资本青睐。2019年3月,万成基因完成500万元天使轮融资;6月,鳌拜智汇完成A轮融资,新格源生物完成近亿元pre-A轮融资;10月,寻因生物完成数千万pre-A轮融资。

单细胞测序是从单个细胞水平对基因组进行测序,将基因测序应用于单个细胞水平,从而识别特定细胞的健康或状态的细胞类型、功能、变化和变异。基于NGS的常规基因检测是在大量细胞的宏观水平上分析整个细胞群体。

近年来,对单细胞测序的研究日益增多。到2019年,已有1338篇科学文献发表在Pubmed上。该技术已广泛应用于神经生物学、物种传播、器官生长、癌症生物学等多个领域。

数据来源:Pubmed,动脉网排列。

单细胞测序是单细胞遗传物质分析的重要手段,并不是单细胞研究的全部。放眼世界,单细胞研究已经发展成为多组学研究,包括单细胞转录组、基因组、表观组、甲基化、ChlP、蛋白质组等。总的来说主要集中在两个领域:单细胞遗传物质分析和单细胞蛋白质分析。

全球单细胞测序始于2009年。时任北京大学教授唐福畴在博士后期间发表了世界上第一篇单细胞mRNA测序文章,引起业界广泛关注。2012年,美国单细胞高通量测序公司10x Genomics和Mission Bio相继成立。单细胞测序技术在中国的应用始于2014年,但大多集中在低通量领域,应用仅限于植入前基因检测(PGD)、外周循环肿瘤细胞(CTC)等。

单细胞测序技术的发展;

(图片来源:单细胞测序技术的进展和应用,动脉网络图)

在高通量测序领域,专注于试剂盒和微流控装置研发的企业,如寻因生物(2015)、微生物(2017)、新细胞生物(2018)、万成基因(2018),自主研发了核心技术微流控,将单细胞测序从实验室带入市场,完成早期融资;专注单细胞信用分析的代表企业鳌拜智汇(2018)也完成了IDG资本的A轮融资。

在基因层面,单细胞测序可以获得更准确的遗传信息。在蛋白质层面,通过分析单细胞表达的蛋白质,可以直接获得人类免疫相关的靶点,用于免疫诊断、新药研发等。鉴于蛋白质不具有直接扩增的特性,蛋白质组学分析的灵敏度有限,单细胞蛋白质分析常用且有效的技术是质谱,主要技术有质谱细胞仪和TOF-SIMS分析。

质谱流式技术平台最初由美国DVS科学公司开发,但这家企业在2014年被美国Fluidigm公司以2.1亿美元收购。国内单细胞蛋白分析的代表企业有辰安生物和宝腾。其中,辰安生物专注于单细胞质谱流动诊断设备、试剂和软件的研发,质子致力于以单细胞蛋白质水平研究为核心的检测服务。

单细胞分析技术在基因层面和蛋白质层面都已经成熟,但由于成本的原因并没有在市场上广泛应用,更多的是为科研提供服务。动脉网梳理了目前全球单细胞行业的发展状况,以及单细胞技术在赢得大规模应用之前所面临的挑战和机遇。

核心技术:单细胞测序与质谱流式细胞术

单细胞测序有四个主要工作流程:单细胞制备、单细胞分离和文库制备、测序和初步分析以及信息分析。单细胞制备通常使用机械方法、酶水解或其他组合方案将组织裂解,然后富集和标记特定的细胞群成为单细胞样品。单细胞分离和文库制备是单细胞测序的关键步骤,与最终单细胞数据的质量和准确性密切相关。

低通量单细胞分离方法包括梯度稀释、口腔移液、自动显微操作、激光捕获显微切割等。但由于一次只能处理一个细胞,日处理量为10个细胞,效率低,成本高,应用受限,本文不赘述。

有三种主要的高通量单细胞分离方法,即微孔法、微流控法和液滴法,所有这些方法都基于微流控原理。

基于微孔的捕获技术可以使用细胞移液器或激光捕获来分离细胞,并将其置于微流控井中。与其他两种方法相比,细胞通量低,只能用于转录组测序,不能用于其他基因组学。代表企业有BD Biosicence、Cell Mircrosystem、Cellsee等。

微液技术是在微米尺度的结构中操纵微量液体的科学技术,它将单细胞培养、制备、反应、分离、检测等步骤集成在一个微米级的芯片上,自动完成整个分析过程。与微孔相比,微流控技术具有更高的细胞通量,但缺点是只能捕获10%的细胞,这意味着企业包括Fluidigm。微流控芯片是微流控技术的核心屏障。在传统单相微流控芯片的基础上,逐渐发展为液滴芯片,以液滴芯片为核心的微流控技术成为液滴。水滴得到了广泛的关注和应用,代表企业有10x基因组、万成基因、1Cellbio、Mission Bio、白云石生物等。

捕获单细胞样本,分离得到活性单细胞,然后扩增活性单细胞的遗传信息,建立测序文库。最后用Illumina测序系统对单细胞文库进行测序,并对遗传物质进行分析。

目前,国内单细胞测序企业大多专注于高通量单细胞转录组测序设备、试剂和微流控芯片的研发,积极探索高通量单细胞组学测序相关技术。

(从上到下依次是Cell Mircosystem的微孔产品CellRaft,Fluidigm的微液捕获技术C1,10x Genomics的微滴系统Chromium)。

用于单细胞蛋白质分析的质谱计是一种将流式细胞术和质谱学相结合的新技术。

简单来说,就是利用质谱原理和独特的金属标记抗体标记细胞表面和内部蛋白质,对单个细胞进行多参数检测的流动技术。

它继承了传统流式细胞仪高速分析的特点,又具有质谱的高分辨率。它可以在单细胞水平上同时分析50多种细胞参数。与常规流式细胞仪分析4-10种蛋白质相比,大大提高了分析效率,是流式细胞仪新的发展方向。

细胞表面和内部的信号分子被质谱中的金属元素标记物(通常是金属元素标记的特异性抗体)标记或识别,然后通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)观察单个细胞的原子质谱。最后将原子质谱的数据转化为细胞表面和内部的信号分子数据,并通过专业的分析软件对得到的数据进行分析,从而实现对细胞生物标志物和信号网络的观察和分析。代表企业有Fluidigm和辰安生物。

单细胞测序和蛋白质研究虽然使用的核心技术不同,但其本质都是从单细胞水平探索和探究基因和蛋白质在体内的作用机制,两者各有侧重和优势。单细胞测序核心技术的微流控检测对象是核酸,核酸以其高通量的检测能力在单细胞转录组、基因组和表观基因组的研究中起着非常关键的作用。

现有技术可以同时分析10000个细胞。虽然市面上有很多基因数据分析软件,但是整个数据库的建立、测序、数据分析仍然需要较长的时间,单次测序时间至少两周,测序成本较高。

单细胞蛋白分析的核心技术是质谱流式细胞术,检测细胞内或细胞表面蛋白,因此在复杂疾病的诊断中更具优势,包括血液系统疾病、肿瘤免疫治疗和免疫系统疾病。质谱流式细胞仪可以分析和检测多达100万个细胞的50种不同的生物标志物。由于质谱的壁垒较高,单细胞的质谱软件很少,通常需要企业自己开发,但整体单细胞蛋白质分析耗时较短,为1-2小时。

单细胞领域企业列表:

总的来说,国内单细胞技术领域主要集中在单细胞测序技术平台的研发和核心技术壁垒的建设上。专注于提供单细胞信息分析服务的企业很少,涉足单细胞蛋白质领域的企业也很少,单细胞蛋白质领域还是有一定市场的空。

单细胞测序技术的应用已经广泛应用于科学研究中,最直接的应用是转化医学研究、肿瘤免疫的伴随诊断和用药指导。包括肿瘤免疫治疗的评价、伴随诊断、疗效评价、肿瘤的个体化用药指导、肿瘤和疾病标志物的识别、细胞群变化等。

比如肿瘤新抗原治疗,就是单细胞测序技术和临床应用早期结合的一个应用方向。新肿瘤抗原是个体化治疗方案。每个人的肿瘤细胞都有特定的抗原,因此研究人员可以预测新的抗原,并进行针对性的治疗。

检测新抗原的存在和抗原性是基于DNA而不是基因表达,需要结合单细胞测序来确定新抗原的表达强度,从而实现快速筛查。

再比如,在液体活检领域,生物医学科学院史教授发现,检测CTC(循环肿瘤细胞)可用于肿瘤的早期筛查和肿瘤转移的检测,但CTC细胞具有异质性,不同的技术路线会捕获不同纯度和亚型的CTC,因此很难通过检测到的CTC来判断肿瘤是否具有转移性。

单细胞测序技术可以检测和区分极少量的CTC,有望探索CTC的临床价值。

单细胞测序也可用于微生物研究、神经科学、免疫学和其他领域,包括:

1、用于新物种鉴定、病原体进化、耐药性检测、临床诊断等微生物分析。

2.用于探索神经元细胞的亚型,分析其与神经科学中阿尔茨海默病、帕金森病、精神分裂症、抑郁症等疾病的发病机制的关系。

3.免疫学领域的研究,如精确检测单个免疫细胞的遗传物质,分析单个免疫细胞而非组织群免疫细胞在免疫机制中的作用。

单细胞蛋白质组学在肿瘤免疫治疗中也有应用潜力,其主要应用包括:

1.通过检测血液蛋白,我们可以找到癌症早期诊断的生物标志物组合,并指导分子靶向治疗。

2.探索免疫治疗的细胞途径和机制,并预测治疗反应。

当然,单细胞蛋白质组学的应用并不局限于肿瘤免疫领域,已经应用于免疫学、干细胞和疫苗研究中的基础研究、药物开发和转化研究。下面我们将列举单细胞领域的企业,了解单细胞组学在科研和临床上的应用和产业化现状。

10x基因组学

10x Genomics成立于2012年,向全球提供单细胞测序设备,已推出单细胞测序平台GemCode和Chromium。其中,Chromium平台增加了构建单细胞转录数据库的功能,一次可获取多达6000个细胞的单细胞转录组数据。10X正在与安捷伦合作开发外显子单细胞测序产品。

2018年,10x先后收购了表观遗传学公司Epinomics和基因组技术公司Spatial Transcriptomics空,以提高其在RNA测序方面的能力。2019年9月,10x Genomics在纳斯达克上市,IPO 3.9亿美元。

万成基因

万成基因成立于2018年,专注于高通量单细胞测序平台的自主研发,包括微流控器件、微滴芯片、多组试剂、分析软件等。,一次可以并行分析10,000个细胞。

万成基因已完成500万元天使轮融资。除了转录组和ATAC,该公司开发的最新产品涵盖了表观遗传学领域,如单细胞甲基化和ChlP。与在美国上市的单细胞测序公司10x Genomics相比,万成基因不仅是单细胞测序上游的仪器和试剂供应商,还为最终用户提供系统的单细胞研究解决方案,包括从研究设计、样品制备到生命分析的全方位服务。

目前,万成基因正在与多家免疫相关公司探索单细胞测序技术在抗体研发、TCR筛查、新抗原检测中的应用。

辰安生物

辰安生物科技成立于2015年,专注于自主研发质谱流式细胞仪技术平台,实现高通量单细胞蛋白质分析。该平台包括核心试剂、用于标记细胞蛋白质的独特金属标记抗体、设备和仪器以及质谱数据分析软件。

公司已完成数千万A+轮融资。与国外标杆公司Fluidigm(最早由DVS科学研发,后被Fluidigm收购)的质谱流式技术平台不同,辰安生物研发的质谱流式技术平台专注于临床应用。

辰安生物的高性能质谱流式细胞仪技术,可实现单细胞50种蛋白质表达水平的分析,专注于血液病的诊断和肿瘤免疫治疗诊断产品的研发。

总结

尽管微流控技术、测序技术和质谱流式细胞术的发展已经实现了在单细胞水平上对遗传物质和蛋白质的分析和检测,并广泛应用于科学研究中,但要将其产业化仍面临诸多挑战。

百度创投认为,单细胞检测分析的产业化有三个难点:

1.工程迭代周期长,从工程稳定到下游应用分析全链条实现技术。单细胞多组学分析的质量受到单细胞捕获效率、试剂体系、设备通量、准确度等条件的制约,涉及微流控技术、极小分析定量、海量生物数据分析等核心技术,对团队的综合能力要求极高;

2.单细胞检测成本高,单细胞多组分析是一项综合性、系统性的工程。从单细胞样本的制备、分离和捕获,到基因测序或在计算机上进行蛋白质检测,一个大样本的检测量已经变成一万个单细胞样本,目前的使用成本还不适合大规模临床使用;

3.很难把数据分析和临床需求结合起来。单细胞分析将获得更复杂的基因和蛋白质数据。这些数据与临床表型如何关联,如何分析,是单细胞信息分析的难点。因此,要大规模应用单细胞多病理研究,需要从整体层面和各个环节降低成本,克服技术壁垒,找到单细胞数据与临床的重合点。

合力投资指出,单细胞测序的核心在于测序前处理,难点在于如何形成规模效应,及时处理样本,富集测试细胞,然后在单细胞水平准确标记和区分不同细胞,形成单细胞水平和分子水平的标签,这对样本处理是一个极大的挑战。

此外,单细胞水平数据分析比细胞团水平数据分析具有更高的数据维度,每个单细胞数据都可能成为数据分析的新维度,这使得单细胞测序数据分析难以取得突破。

在产业化方面,单细胞测序有两个很有前景的产业化机会。一个是单细胞测序仪的设计开发,其中10x基因组学是典型;另一种是临床应用,即通过不断升级迭代,降低单细胞测序的成本,使单细胞测序的价格达到临床可接受或可负担的水平,最终广泛应用于临床。

从2009年到2019年,经过十几年的发展,随着基因测序成本的降低,微流控、质量流式细胞仪等核心技术取得突破,基于单细胞水平的遗传物质和蛋白质分析被广泛应用于免疫、微生物研究、神经科学等科研领域。

但是由于成本高、门槛高、分析难度大,单细胞分析还没有达到大规模应用的水平。目前更多用于攻克癌症、免疫等疾病领域的难题。单细胞领域的企业刚刚起步,大多集中在多组分析中的转录组和蛋白质组领域。

可以预见,随着10x基因组学的上市和单细胞组学研究的深入,基因测序的成本将进一步降低,基于单细胞水平的测序和蛋白质分析具有巨大的发展潜力,为人们了解疾病、免疫机制和药物发现提供了新的视角和方案。

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